标曲拟合

数据分析

• 1.R²多少合格？

  R²可以判断拟合标曲的可靠度， R²＞0.99的标曲才能保证样本计算结果的准确性。如果个别标曲孔由于操作误差而影响了标曲的拟合线性，可以减少/剔除个别标曲孔后拟合，不会明显影响样本结果的计算。

• 2.哪些原因导致ELISA标准曲线拟合不成功?

  1. 数据处理原因：采用了不适宜的拟合方法，如直线、多项式拟合等；

  2. 实验操作原因：标准曲线呈现跳孔、花板的现象，拟合的4PL曲线方程R2小于0.99时，请排查是否出现下列原因：

  -试剂盒保存不当；

  -样本或试剂稀释不均匀；

  -未更换枪头、枪头误差大或枪头触碰孔底孔壁而划伤包被原；

  -上样过程产生气泡或者加到孔壁；

  -加样时间过长，各孔初始孵育温度不一致；

  -洗板不完全，出现交叉污染或者有残留；

  -恒温箱孵育时板孔未贴覆膜或将覆膜反复使用；或使用水浴锅孵育；

  -试剂污染，主要是洗涤液污染或未现配现用；

  -操作误差导致单个浓度点OD值严重偏离曲线，可以剔除后拟合标曲；

• 3.试剂盒要使用多次，但样本较多，是否可以只做一次标曲？

  虽然 ELISA 的操作步骤是相同的，但每次实验的各种影响因数都是有所变化的，所以每次实验时必须重新制作标准曲线，以便得到更准确可靠的检测结果。

  如果需要做多次实验，溶解后的最高浓度标准品可以分装保存于-20℃，避免反复冻融，半个月内使用有效(若说明书有额外强调溶解后标准品的保存和使用，请参照说明书的要求)。

• 4.说明书中的标曲可以直接用来计算吗？若实际标曲的OD值及图像与说明书上有差异是什么原因？

  说明书上的标曲是指示标曲，主要是用于呈现拟合后标曲的形态以及最高/最低OD值的质控范围，您不能直接使用。此外，受实验操作、实验环境以及仪器参数设定等因素的影响，您实际做的标曲OD值可能会跟说明书不完全一致（整体偏高或偏低），这种情况，建议通过在显色阶段控制前4个蓝色孔有明显颜色梯度以及标曲最大OD值在1.2以上，标曲的相关系数在0.99以上即可作为有效标曲。

• 5.样本总是在标准曲线之外，超出最高浓度标准样本的OD值，稀释倍数很高仍然如此，什么原因造成的？

  在设置稀释倍数之前，需要参考相关文献，对于一些表达量极高的蛋白，确实会出现这种情况，建议继续提高稀释比例或咨询技术支持。此外，可能是：

  -样本处理不当，含非特异性显色或干扰显色的内源性成分(脂质、胆红素、血红蛋白或血液粘度过大等)；

  -样本污染，含非特异性显色或干扰显色的外源性成分；

  -组织匀浆或细胞提取液中引入其他组分导致基质效应等。

• 6.样本OD值都低于标准曲线的最低值，主要原因是什么？

  夹心法：

  -标本处理不当，比如加入叠氮钠作为防腐剂，影响显色；

  -组织匀浆或细胞提取液中引入SDS等化学物质后影响抗原抗体的有效结合；

  -样本浓度较低(样本实际浓度低/样本保存不当有降解/样本稀释倍数过大)；

  -样本浓度很高，稀释倍数不够，出现钩状效应；

  -样本类型特殊，与试剂盒不兼容；

  -样本为重组蛋白，抗体和抗原的结构不匹配等。

  竞争法：

  --样本浓度过高，需要提高稀释比例。

• 7.样本OD值出现负值，可能原因是什么？

  可能是由于操作误差导致空白孔跟样本孔交叉污染或被其他成分污染，空白孔OD值异常升高，仪器自动使用空白孔OD值校正样本OD值后，浓度低的样本会出现OD值为负值的情况。